Tipi di microscopi a fluorescenza

Quando i microscopi furono inventati intorno al 1600 d.C., i filosofi naturali volsero i loro occhi su un mondo nel mondo. Quando Antony van Leeuwenhoek ha realizzato piccole lenti molto curve e un supporto meccanico per regolare la vista, ha aperto una finestra sul mondo microscopico dei batteri, delle cellule del sangue, dei protozoi e della struttura cellulare delle piante. Ma nella storia della microscopia, c'è sempre stata una domanda: cosa sono queste strane cose viste attraverso una lente? La microscopia a fluorescenza si riferisce a una serie di tecniche che riducono al minimo tale incertezza, perché nella microscopia a fluorescenza quando la luce viene riflessa su un campione, restituisce la propria luce.

Epifluorescenza

Il microscopio a fluorescenza di gran lunga più comune è la configurazione a epifluorescenza. In un microscopio a epifluorescenza, una sorgente luminosa, tipicamente una lampada al mercurio o allo xeno, brilla attraverso un filtro che seleziona una ristretta regione di lunghezze d'onda. La luce filtrata risplende sul campione attraverso la lente dell'obiettivo del microscopio. La luce in entrata viene assorbita dai fluorofori, etichette molecolari che emettono luce di lunghezza d'onda lunga quando assorbono luce di lunghezza d'onda più corta. La luce dei fluorofori, insieme alla luce diffusa dalla sorgente di illuminazione, torna nella lente dell'obiettivo e al rivelatore o all'occhio. Lungo la strada, un altro filtro blocca la luce di illuminazione, quindi tutto ciò che rimane è la luce fluorescente del campione.

confocale

Un microscopio a epifluorescenza raccoglie la luce da ogni punto del campo visivo del microscopio. Parte della luce di eccitazione viene assorbita prima del piano focale del microscopio, parte sul piano focale e parte oltre il piano focale. Poiché il microscopio raccoglie tutta quella luce, l'immagine conterrà un'immagine nitida della luce a fuoco, ma avrà anche luce sfocata proveniente da altre regioni. Un microscopio confocale fissa che, mettendo a fuoco un punto laser nello stesso piano in cui viene messo a fuoco il microscopio. Quindi, un foro passa davanti al rivelatore, dove blocca tutta la luce che non proviene dal fuoco del microscopio. Scansionando il campione, è possibile ottenere un'immagine tridimensionale pulita dell'oggetto.

Multifotone

In un microscopio confocale l'allineamento è molto sensibile. Se il punto laser, l'obiettivo del microscopio, l'ottica di raccolta e il foro stenopeico sono disallineati anche minimamente, le prestazioni del microscopio ne risentono. Un microscopio multifotonico aggira questo problema utilizzando una lunghezza d'onda del laser che è energetica solo la metà di quella necessaria per eccitare i fluorofori nel campione. L'unico modo in cui i fluorofori si eccitano ed emettono fluorescenza è se la luce laser è abbastanza brillante in modo che due particelle di luce - fotoni - colpiscano il fluoroforo in un tempo molto breve. Ciò accade solo quando il laser è focalizzato su un punto molto piccolo. Quindi l'unico punto nel campione che emetterà luce è dove è focalizzato il laser, il che mantiene l'immagine bella e pulita perché non c'è luce di sfondo extra da eliminare, il che significa nessun foro stenopeico da allineare.

Fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Un altro modo per ottenere immagini molto nitide è assicurarsi che la luce di eccitazione non entri molto nel campione. Se una goccia di neuroni, ad esempio, viene posta in una goccia di soluzione su un vetrino, alcuni neuroni aderiranno alla superficie del vetro. In un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) la luce è diretta lateralmente nel vetrino in modo che non entri realmente nella soluzione che contiene le cellule. Ma parte della luce penetra appena nella soluzione, proprio molto vicino alla superficie del vetro. Ciò significa che gli unici luoghi che emettono luce saranno in una regione molto sottile proprio contro la superficie del vetro. Per qualcosa come i neuroni, dove accadono così tante cose interessanti sulla superficie delle cellule, questa tecnica può essere molto efficace.

Super-Risoluzione

Tutti i microscopi, compresi i microscopi a fluorescenza, sono limitati dalla fisica che governa la propagazione della luce. Una delle regole di base è che un punto di luce focalizzato può diventare solo così piccolo e non più piccolo. Per la luce visibile, quella dimensione è di circa 200 nanometri, o 200 miliardesimi di metro. Ma le singole molecole hanno una dimensione di pochi nanometri, quindi ci sono molte caratteristiche interessanti che sono al di sotto di quel limite di dimensione, chiamato limite di diffrazione. Gli scienziati stanno sviluppando tecniche di "super risoluzione" per aggirare questo limite. La microscopia ad illuminazione strutturata (SIM) e la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), ad esempio, sono entrambi metodi di microscopia a fluorescenza che limitano la dimensione del punto di emissione della luce riducendo la dimensione del punto luminoso di eccitazione.